Приготування середовищ

Відео: Як приготувати агарове середовище

Посуд для приготування середовищ не повинна містити сторонніх речовин, наприклад лугів, що виділяються деякими сортами скла, або оксидів заліза, які можуть потрапити в середу при варінні її в іржавих каструлях. Найкраще користуватися скляному, емальованому або алюмінієвим посудом. Великі кількості середовища (десятки і сотні літрів) готують в спеціальних виручених котлах або реакторах. Перед вживанням посуд необхідно ретельно вимити, прополоскати і висушити. Нову скляний посуд попередньо кип`ятять 30 хв в 1-2% розчині соляної кислоти або занурюють в цей розчин на ніч, після чого протягом години прополіскують в проточній воді. (Посудом, призначеної для приготування середовищ, не можна користуватися в інших цілях, наприклад для зберігання хімічних реактивів або дезінфікуючих розчинів - навіть сліди цих речовин можуть поміщати росту мікроорганізмів.)

Початковою сировиною для приготування більшості середовищ служать продукти тваринного або рослинного походження: м`ясо та його замінники, молоко, яйця, картопля, соя, кукурудза, дріжджі та ін.

Основні поживні бульйони готують на м`ясній воді або на різних переварити, отриманих при кислотному або ферментативному гідролізі вихідної сировини. Бульйони з Переваров в 5-10 разів економічніше, ніж з м`ясної води. Середовища на переварити багатшими амінокислотами, отже, пітательнее- мають більшу буферностью, т. Е. Мають більш стабільну величину рН. Крім того, препарати можна готувати із замінників м`яса (згустків крові, плаценти, казеїну і т. Д.).

В даний час постачання лабораторій м`ясної водою і переварити централізовано. Найчастіше користуються панкреатическим переварити Хоттингера, гідролізатами казеїну або кормових дріжджів. З цих напівфабрикатів, за певними рецептами, готують необхідні середовища.

Етапи приготування середовищ: 1) варка- 2) встановлення оптимальної величини рН 3) осветленіе- 4) фільтрація- 5) разлів- 6) стерілізація- 7) контроль.

Варять середовища на відкритому вогні, водяній бані, в автоклаві або виручених котлах, що підігріваються парою.

Встановлення рН середовищ орієнтовно виробляють за допомогою індикаторних папірців. Для точного визначення рН використовують потенціометр.

Розливають середовища в пробірки (по 3-5 мл або по 10 мл), флакони, колби, матриці і пляшки не більше ніж на 23 ємності, так як при стерилізації можуть намокнути пробки і середовища втратять стерильність.

Середовища, які стерилізують при температурі вище 100 ° С, розливають в чисту суху посуд. Середовища, що стерилізуються при більш низькій температурі, обов`язково разли вають в стерильний посуд.

Розливають середовища за допомогою воронки, на кінець якої * надіта гумова трубка з затиском Мора. Для мірного розливу застосовують мензурки, бюретки, дозатори, шприци-піпетки і т. П.

Посуд із середовищем зазвичай закривають ватно-марлевими пробками, поверх яких надягають паперові ковпачки. Важливо, щоб при розливі середовище не змочувала краю посуду, інакше до них можуть прилипнути пробки. До кожного судині обов`язково прикріплюють етикетку з назвою середовища і тієї її приготування.

Стерилізація. Режим стерилізації залежить від складу середовища і вказано в її рецепті. Орієнтовна схема режиму сте- | рілізаціі середовищ приведена в таблиці.

Режим стерилізації середовищ

Режим стерилізації | Ц

апарат

Температура, тиск

прості



автоклав

120 ° С (1 атм)

20 хв

Складні: 1) з вуглеводами, молоком, желатином

Автоклавирование із закритою кришкою або апарат Коха

100 ° С (текучий пар)

30- 60 хв 3 дні поспіль (подрібнена стерилізація)

2) білкові (сироваткові або яєчні) з ущільненням

Свертиватель Коха (можливі два режими)

80-85 ° С

1 ч 3 дні поспіль

1 ч одноразово |

3) білкові, рідкі

Водяна баня або інактиватор

1 ч 3 - 4 дні поспіль Ш

Контроль готових середовищ: а) для контролю стерильності середовища ставлять в термостат на 2 діб., Після чого їх просматрі- ^ ють. Якщо на середовищах не з`являться ознаки зростання, їх вважають стерильними і передають для хімічного контролю пс кілька зразків кожної серії-б) хімічний контроль: остаточно встановлюють рН, вміст загального та амінного азоту, пептона, хлоридів (мул кількість повинна відповідати зазначеному в рецепті).

Хімічний контроль середовищ виробляють в хімічній лабораторії-в) для біологічного контролю кілька зразків середовища засівають спеціально підібраними культурами мікроорганізмів, і по їх зростанню судять про поживних (ростових) властивості середовища. До готової середовищі докладають етикетку і паспорт, в якому вказують назву і склад середовища, результати контролю і ін.

Зберігають середовища при кімнатній температурі в шафах, бажано спеціально для них призначених. Деякі середовища, наприклад, середовища з кров`ю і вітамінами, зберігають в холодильнику.

Рецепти приготування простих (основних) середовищ і ізотонічного розчину натрію хлориду

Ізотонічний розчин натрію хлориду. До 1 л дистильованої води додають 9 г натрію хлориду. Розчин фільтрують, встановлюють заданий рН і, якщо потрібно, стерилізують при 120 ° С протягом 30 хв.

Мясопептонний бульйон (МПБ). До м`ясної води додають 1% пептона і 0,5% х. ч. натрію хлориду, кип`ятять на слабкому вогні 10-15 хв для розчинення речовин, встановлюють потрібний рН і знову кип`ятять 30-40 хв до випадання осаду. Фільтрують, доливають до початкового об`єму водою і стерилізують 20 хв при 120 ° С.

Бульйон Хоттингера. Перевар Хоттингера розводять водою 5-6 разів залежно від того, яка кількість амінного азоту він містить і яке його кількість повинна бути в бульйоні (вказано в паспорті переварити і рецепті середовища). Наприклад, для приготування середовища з 1,2 гл амінного азоту перевар, що містить 9,0 гл, треба розвести в 7,5 раз (9,0: 1,2). До розлученій переварити додають 0,5% натрію хлориду і кип`ятять на слабкому вогні до розчинення солі. У остигнула середовищі встановлюють рН, фільтрують, розливають і стерилізують 20 хв при 120 ° С.

Мясопептонний агар (МПА). До готового бульйону (до стерилізації або після неї) додають 2-3% подрібненого агар-агар і кип`ятять, помішуючи, на слабкому вогні до- повного розплавлення агару. МПА можна варити в автоклаві або апараті Коха. Готове середовище, якщо потрібно, освітлюють, фільтрують і стерилізують 20 хв при 120 ° С. Напіврідкий агар містить 0,4-0,5% агар-агару.

Поживний желатин. До готового бульйону додають 10-15% желатину, підігрівають до його розплавлення (не кип`ятити!), Розливають в стерильну посуд і сте-i ріліз текучим паром.

Рецепти приготування складних середовищ Середовища з вуглеводами. До основного бульйону або розплав-1 ленному агару додають потрібну кількість (0,1-2%) певного вуглеводу (наприклад, глюкози). Після його розчинення розливають в стерильну посуд і стерилізують] текучим паром. Оскільки вуглеводи частково руйнуються навіть при такому режимі стерилізації, краще 25- 30% розчин вуглеводів, простерилізувати через бактеріальний фільтр, додавати в потрібному обсязі з дотриманням | асептики до стерильним основним середах. Після контролю] стерильності середовище готове до вживання.

Середовища з кров`ю готують з стерильних простих середовищ, додаючи в асептичних умовах (краще в боксі) від 3 дс 30% (зазвичай 5%) стерильної дефібринованої крові. Агарові середовища перед цим розтоплюють і остуджують дс 45 ° С. При потрібній температурі повинно бути терпиме відчуття гарячого, але не опіку. Після додавання крові, поки середовище не застигла, вміст посудини ретельно перемішують * ють і розливають в чашки або пробірки.

Увага! Середовища з кров`ю розтоплювати не можна - кров виміру | ніт свої властивості. Середовища з сироваткою крові готують так само, як середовища кров`ю. До основних середах додають 10-20% сироватки, яка не містить консерванту і попередньо инактиви-рова при 56 ° С протягом 30 хв на водяній бані або: інактіватори. При інактивації руйнується речовина (комплемент), згубно діє на мікроби.

Середовища з жовчю. До простих середах додають жовч в кількості 10-40% обсягу середовища, встановлюють потрібний рН і стерилізують 20 хв при 120 ° С. Можна стерильну жовч додати до стерильному середовищі в асептичних умовах.

Розлив агарових середовищ в чашки Петрі. Середовища перед розливом розплавляють на водяній бані і охолоджують до 45-50 ° С. Зазвичай для чашки діаметром 9 см достатньо 15-20 мл середовища (висота шару 0,25-0,3 см). Якщо шар вище, на ньому менш контрастно виглядають колонії. При дуже тонкому шарі різко обмежена кількість поживних речовин і вологи (середа швидко висихає) - погіршуються умови культивування.

Розливають середовища в стерильні чашки в асептичних умовах. Чашки ставлять кришкою вгору. Посудина з середовищем беруть в праву руку, тримаючи його біля вогню. Лівою рукою виймають пробку, затиснувши її мізинцем і долонею. Обпалюють шийку посудини і двома пальцями лівої руки злегка відкривають кришку. Вводять під неї горлечко флакона, не торкаючись їм до краю чашки. Наливаючи середу, стежать, щоб вона рівномірно розподілилася по дну чашки. Якщо при розливі на поверхні середовища утворюються бульбашки повітря, до них до того, як середовище застигне, підносять полум`я сірника або пальника - бульбашки луснуть. Потім чашку закривають і дають середовищі застигнути. Якщо посів виробляють в день розливу, середу необхідно підсушити. Для цього чашки в термостаті обережно відкривають і встановлюють кришки і чашки відкритою стороною вниз на 20-30 хв. Якщо посів роблять на наступний день після розливу, чашки, що не підсушуючи, загортають в ту ж папір, в якій їх стерилізували, і поміщають в холодильник.

Приготування скошеного агару. Пробірки з 4-5 мл стерильної розплавленої агарового середовища укладають в похилому положенні (приблизно під кутом 20 °) з таким розрахунком, щоб середовище не заходила за 23 пробірки, інакше вона може змочити пробку. Після того як середовище застигне, пробірки ставлять вертикально - дають стекти конденсату. Краще вживати свіжоскошений агар.

Увага! Користуватися середовищем, в якій немає конденсату, не можна. Її слід знову розтопити на водяній бані і скосити.lt; lt; ПопереднєНаступна gt; gt;

Увага, тільки СЬОГОДНІ!