Лабораторна діагностика

«Золотим стандартом» є виділення збудника. Слід пам`ятати, що матеріал необхідно досліджувати швидко, тому що бактерії схильні до швидкого аутолизу, зумовленого активністю внутрішньоклітинних ферментів. Матеріалом для дослідження є мокротиння, плевральнийвипіт та інші ексудати, спинномозкова рідина, кров, слиз з носа і зіву, виділення очних виразок, виділення з вуха, сеча, шматочки органів (в разі смерті хворого). Сигнальний відповідь на пневмококової інфекцію може бути виданий при виявленні в мазках з харкотиння нейтрофілів і грампозитивних ланцетовідних диплококков (не менше 10 в полі зору). В іншому випадку вдаються до виділення збудника.

Перший етап дослідження. Патологічний матеріал піддають попередній бактеріоскопії (крім крові). Мокротиння поміщають в стерильну чашку Петрі, відмивають, петлею захоплюють гнійно-слизовий грудочку, розтирають на предметному склі, висушують і фарбують по Граму. В мазку виявляють грампозитивні ланцетовидной або овальної форми коки, оточені капсулою (капсулоутворення спостерігається тільки у пневмококів, виділених від хворих і заражених тварин). Виявлення капсул пневмококів можна проводити за методом Буррі-Гінса. Посів патологічного матеріалу виробляють на 5-10% кров`яний або сироватковий агар і на середу збагачення (8-10% сироватковий бульйон). При підозрі на сепсис пневмококової природи 5-10 мл крові хворого засівають на 45-90 мл сироваткового бульйону. Спинно-мозкову рідину, якщо вона прозора, центрифугують і кілька крапель з осаду засівають на поживні середовища. Як середовище збагачення використовують напіврідкий сироватковий агар. Посіви інкубують при 37 ° С 24 години. Кращим методом виділення чистої культури пневмококів є зараження білих мишей патологічним матеріалом. Мокротиння, відмиту в чашці Петрі стерильним фізіологічним розчином, розтирають у стерильній ступці стерильним товкачем або битим склом при додаванні фізіологічного розчину в співвідношенні 1: 2-1: 5. Суспензія відстоюють, надосадову рідину в кількості 0,5-1 мл вводять білим мишам внутрішньоочеревинно. При наявності в матеріалі пневмококів миші гинуть протягом 72 годин. В мазках з органів і крові виявляють типові пневмококи. Також проводять посів органів і крові на сироватковий бульйон і на чашки Петрі з кров`яним або сироватковим агаром.

Другий етап дослідження. Вивчають характер росту на живильних середовищах. На кров`яному агарі колонії пневмококів дрібні, круглі, з рівними

краями, ніжні, оточені зоною позеленіння середовища (що вельми нагадує зростання зеленящіх стрептококів). На сироватковому агарі колонії ніжні, напівпрозорі і прозорі. При бактеріоскопії мазків, забарвлених по Граму. виявляють грампозитивні диплококи без капсул. Після бактеріоскопії колонії, підозрілі на пневмококи пересівати на скошений сироватковий або кров`яний агар або на сироватковий бульйон. При мікроскопії мазків з середи збагачення поряд з різною мікрофлорою можна виявити коки, розташовані парами або короткими ланцюжками. Матеріал з середи збагачення пересівати на щільні поживні середовища. Посіви інкубують при 37 ° С 24 години.

Третій етап дослідження. Па скошеному кров`яному агарі пневмококи утворюють ніжний тонкий напівпрозорий наліт. На сироватковому бульйоні пневмококи викликають помутніння і легкий осад. В мазках з щільних поживних середовищ пневмококи можуть мати різний вигляд. Поряд з диплококами подовженої форми з загостреними зовнішніми кінцями, що нагадують полум`я свічки, зустрічають клітини правильної овальної і круглої форми. У бульонной культурі пневмококи часто розташовуються ланцюжками. Па підставі морфологічних і культуральних властивостей пневмококи важко відрізнити від зеленящіх стрептококів, тому для їх диференціювання запропонований набір спеціальних тестів:

• розчинність в жовчі (дезоксіхолатная проба) -

• здатність розкладати інулін-

• чутливість до оптохіну-

• реакція аглютинації зі специфічними антипневмококовими сивороткамі-

• здатність розкладати глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маніт, сорбіт і салицин.

Найбільш доступними методами, диференціюючими пневмококи від інших стрептококів є проба з оптохіном (пригнічує їх ріст) - від зеленящіх стрептококів їх відрізняє здатність ферментувати інулін, а також чутливість до жовчі.

Дезоксіхолатная проба. Після попередньої бактеріоскопії в пробірку з 5 краплями стерильною бичачої жовчі вносять 10 крапель, виділеної чистої культури (краще бульонной). Контролем служить культура, внесена в пробірку з 5 краплями фізіологічного розчину. Через 30-60 хвилин інкубації при 37 ° С спостерігають повний лізис культури у вигляді просвітлення в пробірці з жовчю, в контрольній пробірці суміш залишається каламутною. Слід пам`ятати, що авірулентние культури пневмокока стійкі до жовчі.

Стійкість до жовчі також можна перевіряти посівом в 10% жовчний бульйон. У середу вносять досліджуваний матеріал, при цьому бульйон мутніє. Після 24-годинної інкубації при 37 ° С на наявність пневмококів вкаже просвітлення бульйону в результаті лізису бактерій.

Також можна використовувати диски, просочені 20% розчином жовчі. Диски завадять на виросла культуру в чашці і інкубують 1-2 години при 37 ° С. При наявності пневмококів колонії лизируются навколо диска на відстані 1 -2 мм.

Проба на інулін. Культуру пневмокока засівають на середу з інулін. Для цього до 100 мл прогрітій при 56 ° С протягом 30 хв бичачої сироватки додають 200 мл стерильної дистильованої води, 18 мл лакмусовим настоянки і 3 г інуліну, стерилізують текучою парою 30 хвилин. Посіви інкубують при 37 ° С 24 години. Пневмококк розкладає інулін, в результаті серед червоніє. Зеленящий стрептокок не викликає почервоніння середовища.

Проба з оптохіном. Випробувану культуру пневмокока засівають на сироватковий бульйон з оптохіном в розведенні 1: 100000 або 1: 200000. Пневмококк на такому середовищі не росте. Також можна визначити чутливість до оптохіну і посівом на 10% кров`яний агар, що містить оптохін в розведенні 1: 50000. Контролем є посів культури на кров`яний агар. Пневмококки не ростуть на середовищі з оптохіном, на контрольному середовищі спостерігається зростання пневмококів. Можна використовувати диски, просочені 6 мкг оптохіна, які накладають після посіву на поверхню середовища. У пневмококів навколо диска утворюється зона затримки росту не менше 18 мм діаметром.

Проба на вірулентність. Добову культуру пневмокока, вирощену на сироватковому бульйоні розводять 1% стерильної пептонною водою (рН - 7,6) або слаболужним бульйоном до 1:10. Розведену культуру вводять внутрішньочеревно білим мишам вагою 16-20 гр в обсязі 0,5 мл і спостерігають протягом 72 годин. З органів загиблої миші роблять висіву на поживні середовища та микроскопируют мазки-отпечаткі.К високовірулентних культурам відносять пневмококи, що викликають загибель мишей після введення культури в розведенні 1:10. Авірулентние культури не викликають загибелі мишей.

Серотіпірованіе пневмококів. 18-годинну культуру перевіряють в реакції мікроаглютинації по Себіна. На предметне скло наносять 4 краплі культури пневмокока. До 1 краплі додають краплю антипневмококковой сироватки типу 1, до 2-ї - сироватку типу II, до 3-й - сироватку - 111, до 4-ї - краплю нормальної сироватки. Суміші на склі перемішують петлею і розглядають під лупою або під мікроскопом при малому збільшенні. У позитивному випадку в одній з перших трьох крапель спостерігається аглютинація. Тип пневмокока визначають в реакції аглютинації зі специфічними аглютинативна сироватками перших трьох фіксованих типів. Культури, що не агглютинируются зазначеними типами сироваток, відносять до Х-групі. Реакцію ставлять в такий спосіб. Розливають 18 - годинну бульонную культуру по 0,5 мл в пробірки. Потім вносять в рівному обсязі сироватки, розведені фізіологічним розчином у співвідношенні 1: 5. Контролями служать 2 пробірки, одна з яких містить випробувану культуру в суміші з

нормальної кролячої сироваткою, а інша - тільки досліджувану культуру. Вміст пробірок ретельно струшують і ставлять на 2 години в термостат при температурі 37 ° С, після чого проводять попередній облік реакції. Остаточні результати відзначають після додаткового витримування при кімнатній температурі протягом 20 годин. Аглютинацію оцінюють на чотири плюса, якщо вміст пробірок повністю прояснюється, а агглютінаціонние культура являє собою щільну плівку, не розбивати при встряхіваніі- на три плюса якщо при повному просвітління вмісту пробірки агглютинируют культура легко розбивається на частини-на два плюса - якщо просвітлення не настає, в каламутному вмісті пробірки добре видно неозброєним оком частки агглютініровалісь культури-при аглютинації на один плюс в пробірці виявляють мелкозернистую суміш склеєних п невмококков. При негативній реакції, видимої оком, аглютинації НЕ наблюдают-

вміст пробірок після струшування є рівномірною муть.

Типування пневмококів Х-групи проводять за допомогою групових сироваток, що містять суміш типових агглютинирующих сироваток, взятих в рівних обсягах. Готують такі групові сироватки шляхом змішування рівних об`ємів нерозведених типових діагностичних сироваток (Lund, I960):

А -1, II, IV, V, XVIII серовари-

В - VI, VIII, XIX серовари-

З - VII, XX. XXIV, XXXI, XL серовари-



D - IX, XI, XVI, XXXVI. XXXVII серовари-

Е - X, XXI. XXXIII, XXXIX серовари-

F - XII. XVII. XXII, XXXVII, XXXII, XLI серовари-

G - XIII, XXV. XXIX, XXXIV, XXXV, XXXVIII, XLII, XLVII серовари-

J - XLIII. XLIV, XLV, XLVI серовар.

Агглютинируют сироватку III типу використовують per se (без змішування з іншими типовими сироватками) через труднощі її отримання в досить високому титрі. Типування проводять в два прийоми: спочатку за допомогою групових сироваток, а потім з індивідуальними сироватками тієї групи, з якою була отримана позитивна реакція. Серотіпірованіе пневмококів застосовують переважно для епідеміологічних досліджень результатів специфічної серотерапії і серопрофилактики.

Мікроаглютинації пневмококів за методом Себіна можна отримати при змішуванні антіпневмококкових сироваток з ексудатом з черевної порожнини миші, зараженої мокротою хворого. Уже через чотири години після зараження в ексудаті виявляють чисту культуру пневмококів, що дає позитивну агглютинацию по Себіна.

Прискорені методи виявлення і типування пневмококів. 1. Метод Нойфельд або феномен набухання капсули пневмокока. По одному грудочки свежевиделенних мокротиння хворого наносять на три

покривних скла, до кожного з них додають краплю нерозведеної специфічної антипневмококковой сироватки (1, II, III типів) і краплю синьки Леффлера. Краплі ретельно змішують, покривають предметним склом з лункою, змащеній по краях вазеліном. Через дві хвилини розглядають висячі краплі під мікроскопом з иммерсионной системою. При позитивному випадку видно різке збільшення капсул пневмококів. При негативному результаті капсули ледь заповітний. Реакція набухання специфічна і не дає позитивного результату з іншими капсульними бактеріями. Її не застосовую г для дослідження мокротиння від хворих, які лікувалися сульфаніламідами і антибіотиками, тому що в цьому випадку можуть виділятися безкапсульние пневмококи.

2. Метод преципітації. 5-10 мл мокротиння кип`ятять на водяній бані до отримання щільного згустку. Згусток розтирають і додають невелику кількість фізіологічного розчину, знову кип`ятять кілька хвилин для добування специфічного полісахариду з пневмококів. Суспензія центрифугируют, з отриманої прозорою рідиною і специфічними типовими сироватками в преціпітаціонних пробірках ставлять реакцію кольцепреціпітаціі. Поява кільця на кордоні дотику рідин вказує на позитивний результат.

3. Визначення капсул пневмококів по Буррі. На кінець предметного скла наносять краплю досліджуваного матеріалу і краплю туші. Суміш перемішують і роблять мазок, висушують на повітрі і, не фіксуючи, микроскопируют. Фон препарату - темно-димчастий, мікробні тіла і їх капсули не фарбується. Препарат, виготовлений по Буррі, можна зафіксувати сумішшю Никифорова, промити водою, пофарбувати фуксином Циля, розведеним 1: 3 протягом 3-5 хвилин. На темному тлі мазка виділяються нефарбовані капсули, всередині яких знаходяться бактерії яскраво малинового кольору (метод Гінса).

Мотивуюча характеристика теми: пневмокок один з основних збудників бактеріальних пневмоній. У разі генералізації інфекції мікроорганізм може гематогенно дисемінований у внутрішні органи і викликати менінгіти, ендокардити, отити, суглобові ураження і т. Д. Знання правілдіагностікі і леченіязаболеваній, викликаних цими мікроорганізмами, необхідно для студентів всіх факультетів.

Студент повинен знати: правила забору матеріалу при інфекціях, викликаних даними мікроорганізмами, препарати для лікування і профілактики захворювань.

Студент повинен вміти:

- фарбувати препарати по Граму, Бурі-Гінсу і простим методом (фуксином) -

- диференціювати мікроби за морфологічними ознаками при мікроскопіі-

- проводити виділення чистої культури мікроорганізму і ідентифікувати його за морфологічними, культуральними, біохімічними та антигенними властивостями.

Студент повинен мати навички:

- дотримання правил протиепідеміологічного режиму і техніки безпеки в бактеріологічній лабораторії-

- знезараження інфікованого матеріалу, антисептичної обробки рук, контамінованих досліджуваним матеріалом, культурами мікроорганізмів

- стерилізації петлі прокаліваніем-

- приготування мікроскопічних препаратів з чистих культур мікробів-

- мікроскопії з иммерсионной сістемой-

- посіву досліджуваного матеріалу петлею, шпателем на щільні і рідкі поживні середовища-

- видачі результатів дослідження-

- читання і оцінки результатів мікробіологічних досліджень. Оснащення занять:

1. Таблиці з лабораторної діагностики пневмококової інфекції.

2. Бланки направлення на аналіз.

3. Препарати для лікування пневмококової інфекції: пеніцилін, левоміцетин, рифампіцин, вінкоміцін, цефтріксон.

4. Предметні скла для приготування мазків і набір фарб для фарбування по Граму і Бурі-Гінсу. Навчальна карта заняття-

1. Вивчити схему лабораторної діагностики пневмококової інфекції по таблиці.

2. Вивчити під мікроскопом мікропрепарати пневмококів, пофарбовані по Граму і методу Бурі-Гінсу.

3. Навчитися писати направлення на дослідження матеріалу від хворого.

4. Заповнити бланк видачі відповіді.

5. Розібрати діагностичні та лікувальні препарати, що застосовуються при пневмококової інфекції.

6. Вивчити склад і правила застосування пневмококової вакцини. Питання для самопідготовки та самоконтролю:

1. Яка морфологія пневмококів?

2. Які їх культуральні і біохімічні властивості?

3. Як можна створити капнофільние умови культивування пневмококів?

4. Який матеріал береться при підозрі на захворювання, викликані пневмококами?

5. Як проводиться бактеріоскопічне дослідження і які методи забарвлення використовують при підозрі на пневмококової інфекцію?

6. Як проводять бактеріологічне дослідження?

7. Як ставиться реакція "набухання капсули"?

5. Як проводиться бактеріоскопічне дослідження і які методи забарвлення використовують при підозрі на пневмококової інфекцію?

6. Як проводять бактеріологічне дослідження?

7. Як ставиться реакція "набухання капсули"?

8. Які препарати використовуються для лікування і профілактики пневмококової інфекції?lt; lt; ПопереднєНаступна gt; gt;

Увага, тільки СЬОГОДНІ!