Методи діагностики інфекційних хвороб

Відео: Майстер-клас "Методи молекулярної біології. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)"

Бактеріологічне дослідження застосовується для виявлення патогенних бактерій в матеріалі від хворих тварин або їх трупів, виявлення мікробів в об`єктах зовнішнього середовища, кормах, м`ясі і т.д.

Досліджуваний матеріал по можливості збирають в асептичних умовах в стерильну посуд (від трупів не пізніше 2-3 годин після смерті тварин, в ряді випадків доцільний вимушений забій 1-2-х з групи хворих тварин) і доставляють в найближчим часом в НЕ консервованому, консервованому (30% -им водним розчином гліцерину або вазеліновим маслом, 0,5% -им розчином фенолу), замороженому (допускається при туберкульозі і ін.) вигляді з супровідним документом в лабораторію (в ньому вказані дата взяття, характер і джерело матеріалу, основні клин етичні ознаки хвороби і патологоанатомічні зміни, мета дослідження).

Бактеріологічні дослідження включає: бактеріоскопію мазків досліджуваного матеріалу, виділення чистої культури бактерій з наступним вивченням морфологічних, культуральних, біохімічних, антигенних та патогенних властивостей бактерій.

Мікроскопія дозволяє виявити в матеріалі мікробів, вивчити їх морфологію (форму, розмір, взаємне розташування клітин, структурні компоненти: капсули, суперечки, джгутики, включення) і тинкторіальних властивості. Для цього з патологічного матеріалу готують мазки-відбитки з органів, тканин або препарати-мазки з іншого досліджуваного матеріалу, висушують на повітрі, фіксують (частіше фламбирования або хімічним способом) і забарвлюють тим чи іншим методом в залежності від спрямованості дослідження. Забарвлення мікробів проводять простим (один барвник) і складним методами (основний і додатковий барвник, допоміжні реактиви) .Сложние методи (Грама, Ціль-Нільсена, Романовського-Гімза, Гінса і ін.) Дозволяють відрізнити одну групу мікробів від іншої, виявити окремі елементи мікробної клітини (спори, капсули).

Для виявлення деяких бактерій (напр., Збудника туберкульозу) патологічний матеріал попередньо обробляють одним з методів збагачення, підвищуючи в ньому концентрацію бактерій і позбавляючись від сторонніх мікробів.

При виявленні бактерій використовують і люмінесцентну мікроскопію. Для визначення рухливості мікробів використовують мікроскопію молодий (12-24 год.) Живої культури за допомогою препаратів «роздавлена або висяча крапля», а також на основі зростання бактерій в напіврідкому МПА.

Виділення культури бактерій проводять шляхом посіву матеріалу на відповідні (в залежності від поживних потреб збудника) поживні середовища. Посів на щільні поживні середовища в бактеріологічних чашках проводять шляхом розтирання шпателем декількох крапель матеріалу по поверхні середовища. При дослідженні паренхіматозних органів убитих або загиблих тварин обпалюють або фламбіруйте шматочок органу, потім надрізають його стерильними ножицями і за допомогою пінцета проводять надрізаної поверхнею по живильному середовищі в чашці. У рідку середу посів матеріалу роблять пастерівської піпеткою. З метою отримання зростання ізольованих колоній (при їх пересівання отримують чисту культуру бактерій) мікробів частіше використовують дробовий посів або пересівання (метод Дрігальского) на кілька чашок з щільною середовищем. Чисту культуру отримують також висіваючи патматеріал на елективні середовища, зараженням лабораторних тварин і прогріванням містить спори матеріалу в водяній бані при 800 С 30 хв.

Засіяні чашки і пробірки інкубують в термостаті при оптимальній для зростання кожного виду бактерій температурі (частіше 370 С) протягом зазвичай 1-2 діб (в окремих випадках до 30-60 діб, наприклад збудник туберкульозу).

Для ідентифікації виділених бактерій вивчають тільки чисті культури. Ідентифікацію проводять всебічним вивченням їх культуральних, морфологічних, біохімічних, серологічних і патогенних властивостей.

При оцінці зростання на рідких поживних середовищах визначають ступінь і характер помутніння середовища, характер осаду, наявність плівки і пристінкового кільця. При вивченні росту мікробів на твердих середовищах звертають увагу на характер росту (убогий, пишний, однорідний або неоднорідний), число колоній, їх величину, форму, структуру, колір, прозорість.

Біохімічну активність вивчають найчастіше на диференційно-діагностичних середовищах (Гисса, Кліглера, Ендо, Крістенсена і ін.), Визначаючи при цьому сахаролитические, протеолітичні і редуцирующие властивості.



Антигенну структуру мікробів вивчають за допомогою різних серологічних реакцій - РА, РН, РП, РСК і ін., Що дозволяють виявити відмінності між спорідненими видами деяких бактерій, а також окремими штамами всередині виду.

Фаготіпірованіе, як метод ідентифікації мікробів, проводять за допомогою бактеріофагів.

Визначення патогенних властивостей бактерій проводять шляхом зараження лабораторних тварин культурами або фільтратом культури (при визначенні токсінообразованія).

Після вивчення властивостей бактерій зіставляють отримані дані з ознаками бактерій, наявними у відповідних інструкціях, ГОСТах з лабораторної діагностики інфекційних захворювань, визначнику бактерій (Д.Берджі, 1994) і проводять їх родову і видову диференціацію. У сумнівних випадках проводять повторне дослідження матеріалу. Результати дослідження записують в журнал бактеріологічних експертиз, вказуючи який мікроб виділений з досліджуваного матеріалу.



Вірусологічне дослідження - комплекс методів дослідження, що дозволяє розпізнати етіологію вірусного захворювання і вивчити його збудника.

Характер і методика взяття проб при різних вірусних хворобах неоднакові. При взятті матеріалу для виділення вірусу слід виходити з плюралізму вірусів. Його відбирають з урахуванням патогенезу досліджуваної інфекції, як можна швидше після появи чітких ознак хвороби або не пізніше 2-3 годин після смерті або забою (спостерігається феномен посмертної аутостерілізаціі і посмертних змін тканин) і швидко поміщають в умови низької температури. Матеріал відправляють в лабораторію в термосі з умовами підтримки низької температури, в скляних флаконах (пробірках) з притертими пробками, або консервованому вигляді 50% -ним растровом гліцерину.

Дослідження необхідно починати відразу після надходження матеріалу. Якщо з якихось причин (відсутність ембріонів птахів, тканинних культур) воно відкладається, надісланий матеріал необхідно помістити в низько - температурний морозильник при - 27 ... 40 ... 700С. Спочатку проводять дослідження, що дозволяють безпосередньо виявити вірус або його антигени в матеріалі - світлову, люмінесцентну (метод імунофлюоресценції), електронну мікроскопію і імуноферментний аналіз.

Світлова і люмінесцентна мікроскопія використовується для виявлення великих вірусів (ст. Віспи), виявлення внутрішньоклітинних включень (напр. Бабеша-Негрі при сказі), вивчення цитопатогенного дії вірусу на клітини (ЦПД), визначення типу нуклеїнової кислоти вірусу (метод флюорох-ромірованія). Для світлової мікроскопії препарати з патологічного матеріалу забарвлюють спеціальними методами: по Морозову, Макіавеллі, Рома-ського-Гімзою - при виявленні віріонов- по Муромцеву, Манну, Туревич і ін. - при виявленні включень. Для люмінесцентної мікроскопії при фарбуванні препаратів використовують флуорохроми (акридин помаранчевий і ін.). Електронна мікроскопія (використовують спеціально приготовлені препарати) дозволяє виявляти вірусні частки в різних матеріалах, диференціювати їх за формою, розміром і ультраструктурі. Метод імунофлюоресценції проводять за допомогою імунних сироваток мічених флюорохромами з метою індикації, ідентифікації вірусів і вірусних агентів.

Імуноферментний аналіз (ІФА) застосовується в гістохімічному і твердофазном варіанті, де використовуються антитіла мічені ферментами (пероксидаза хрону, лужна фосфатаза та ін.). Гістохімічний варіант ІФА призначений для ідентифікації вірусу в патматеріалі або культурі клітин. Твердофазний варіант ІФА використовується як для визначення антигенів, так і визначення антитіл і їх титрів з метою ретроспективної діагностики.

Для виділення вірусу використовують ембріони птахів, культури клітин, лабораторних і природно-сприйнятливих тварин. Підготовку віруссодержащего матеріалу для зараження чутливих об`єктів здійснюють двома методами: за допомогою обробки антибіотиками або шляхом стерилізуючого фільтрування. Потім матеріал піддають бактеріологічному контролю на наявність бактерій, грибів шляхом посіву на МПА, МПБ, МППБ, середу Сабуро і при негативних результатах використовують для зараження. При отриманні негативних результатів проводять не менше трьох пасажів на біологічних об`єктах того ж виду.

При виділенні в випробуваному матеріалі вірусного агента наступним етапом дослідження є ідентифікація вірусу (видова і группоспецифических) за допомогою серологічних методів. З цією метою використовують РН, РСК, РІД, РТГАд, РЗГА, РНГА, ІФА. Дані методи дозволяють виявити також і антитіла в сироватках перехворілих тварин. При цьому необхідно мати дві проби сироватки крові (парні сироватки), взяті на початку і в кінці хвороби (зазвичай через 14 днів). Зберігати сироватки необхідно в холодильнику при 40 С або в замороженому вигляді, суворо дотримуючись порядок нумерації проб і відповідності записів в журналі і на пробах.

В даний час в лабораторіях для ідентифікації збудника використовується полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), що дозволяє визначити нуклеотидну послідовність РНК або ДНК інфекційного агента.

Результати дослідження записують в журнал вірусологічних досліджень. Діагноз на інфекційну хворобу може бути поставлений при обліку епізоотологічних, клінічних і патологоанатомічних даних і результатів лабораторних досліджень.



Мікологічні дослідження - комплекс методів, що застосовуються для виявлення та ідентифікації грибів в досліджуваному матеріалі.

Мікологічні дослідження при діагностиці мікозів включає мікроскопію патологічного матеріалу для виявлення збудника в органах і тканинах хворої тварини, виділення чистої культури та її ідентифікацію. У неясних випадках перевіряють патогенність виділених культур біологічної пробою. Додатково використовують серологічний, алергічний, люмінесцентний методи діагностики. Гістологічне дослідження застосовують для діагностики глибоких мікозів, збудник яких не культивується на поживних середовищах (ріноспорідіоз).

Відбір патологічного матеріалу при дерматомікозах виробляють з периферії свіжих, уражених вогнищ (скоринки, волосся) - при епізоотичному лімфангіті, споротрихозі, актиномикозе, актинобациллезе матеріал беруть із НЕ виявило абсцесів, а також досліджують гранулематозні вогнища після попередньої дезінфекції їх-при вісцеральних мікозах досліджують гній, сечу, органи і тканини, зіскрібки зі слизових оболонок. Патологічний матеріал поміщають в стерильні чашки Петрі (при дерматофітозами можна в чисті стерильні пакети). Для кращого виявлення елементів грибів з патологічного матеріалу готують препарати на предметному склі в краплі 10-20% -ного розчину їдкого натру з наступним додаванням 50% -ного водного розчину гліцерину. Мікроскопують незабарвлені препарати (рідше забарвлені по Граму, лактофуксіном, бавовняної синню, Романовським-Гімзою) при малому збільшенні, потім при х40. Кращі результати дослідження дає фазово-контрастна мікроскопія.

Первинну культуру збудників отримують посівом патологічного матеріалу на агар Сабуро, сусло-агар, кров`яний агар та ін. (10-12 пробірок). При забрудненні сторонньої мікрофлорою можна застосувати передпосівний обробіток патологічного матеріалу (700 етиловим спиртом або 2-4% -ним розчином формаліну 3-6 хв.) Або додати антибіотики в живильне середовище. Оптимальний рН живильного середовища для патогенних грибів складає 6,0-7,2, температура культивування 26-300 С, для окремих представників 370 С. Посіви витримують до 30 діб, так як первинні культури частіше розвиваються повільно (напр. Tr. Verrucosum). Ідентифікацію культур проводять за культурально-морфологічними ознаками, ферментативної активності на спеціальних середовищах. При мікроскопії культур (безпосередньо в чашках або препаратах) виявляють міцеальние тяжі, склероции, плодові тіла, будова і характер розгалуження спорангієносцями, конидиеносцев, форму спорангіев, розташування конідій (ланцюжками або поодиноко), відношення до фарбування. Патогенність культур перевіряють зараженням білих мишей, морських свинок, кроликів через скаріфіцірованную шкіру, підшкірно, інтраперітоніально, внутрішньовенно, інгаляційним шляхом. Серологічні реакції (аглютинації, преципітації, РСК і ін.), Алергічні внутрішньошкірні проби застосовують в комплексі з іншими методами при діагностиці переважно кандидамикоза, гістоплазмозу, епізоотичного лимфангита. Люмінесцентним методом виявляють у тварин мікроспорії.

Для микологического дослідження при діагностиці микотоксикозов беруть середні проби з партій кормів, що викликали алиментарное отруєння тварин. Попередньо виключають інфекційні хвороби, отруєння отруйними рослинами і отрутохімікатами. Використовують органолептичний, мікологічний, токсико-біологічний і фізико-хімічний методи.

При органолептичному аналізі враховують вологість, колір, запах, іноді смак, а також видимі ураження корму грибами. Мікологічні дослідження включає: первинне виділення грибів з кормів, кількісний облік і диференціацію їх, виділення чистих культур грибів. Виділення токсичних варіантів грибів з досліджуваних зразків корму - вирішальний момент в діагностиці микотоксикозов. Токсичність зразків корму і культур грибів визначають шкірною пробою на кроликах, найпростіших (інфузорій стілоніхіях) і згодовуванням лабораторним тваринам. Фізико-хімічний аналіз полягає в ізоляції, якісному і кількісному визначенні в кормах і культурах грибів афлатоксинов, мікотоксину (Т-2), зеараленону (Ф-2) шляхом тонкошарової хроматографії в поєднанні з люмінесцентної мікроскопії.lt; lt; ПопереднєНаступна gt; gt;

Увага, тільки СЬОГОДНІ!