Лабораторна діагностика сифілісу
Відео: Імуноферментний аналіз (ІФА-діагностика)
Виявлення блідих трепонем в біологічному матеріалі.А) Темнопольна мікроскопія.
Найбільш переконливим доказом трепонемной природи захворювання є пряма візуалізація трепонем.Прі первинному сифілісі на бліду трепонем досліджують відділення ерозивновиразкових папульозні елементи в області статевих органів, порожнини рота, в пунктаті з регіонарних лімфатичних вузлів. При вторинному сифілісі використовується матеріал з різних уражень шкіри і слизових оболонок. Для діагностики вродженого сифілісу може бути використана амниотическая жідкость.Прі мікроскопічному дослідженні блідітрепонеми мають вигляд тонкої спіралі з 8 -12 рівномірними завитками. У темному полі зору можна спостерігати поступальний обертання трепонеми навколо осі, ротаційне і згинальні. Важливою ознакою є злам в середній частині ( "пригладжений праскою"), що відрізняє збудника сифілісу від інших трепонем.Прі негативних результатах мікроскопічне дослідження повторюють або до виявлення блідої трепонеми, або до підтвердження діагнозу результатами серологічного ісследованія.Обнаруженіе специфічних мікроорганізмів з характерною морфологією, рухливістю і антигенної специфічністю дозволяє поставити діагноз сифілісу при первинному, вторинному, ранньому природженому, рецидивний сифіліс навіть без врахування результатів серологічних тестів. Слід враховувати, що відсутність мікроорганізмів ще не виключає діагноз сифілісу. Відсутність трепонем в типових осередках ураження може бути обумовлена тривалістю існування осередку, попередніми лікуванням пацієнта або поганою технікою взяття зразка або перегляду матеріалу. При відсутності збудників в осередку ураження слід виключити можливість інших захворювань (герпес, м`який шанкр).
Б) Полімеразна ланцюгова реакція.
Застосовується для визначення специфічних послідовностей ДНК. Метод полягає в багаторазовому збільшенні (ампліфікації) кількості ДНК діагностується мікроорганізму. Розробка варіантів ПЛР для діагностики сифілісу обумовлюється недостатністю стандартних тестів при ранньому серонегативном, природженому сифілісі і нейросифилисе. Виявлення T. pallidum за допомогою ПЛР значно полегшується вираженим генетичним консерватизмом і практичною відсутністю рекомбінації навіть між підвидами. Великою перевагою ПЛР є можливість автоматизації реакції шляхом заданого циклічного температурного режіма.Прімененіе ПЛР може мати велике значення при діагностиці вродженого сифілісу (пасивний трансплацентарний перенесення антитіл не впливає на результати тесту), нейросифілісу (чутливість існуючих тестів близько 50%), первинного серонегативного (в даний час одним із критеріїв є пряме мікроскопічне виявлення трепонем), а також при діагностиці сифілісу у ВІЛ-інфікованих.
2. Нертрепонемние тести.
Нетрепонемні тести визначають антитіла класу IgG і IgM до ліпідів (фосфоліпідів), ліпопротеїдів, що вивільняються з ушкоджених клітин господаря, внаслідок сифілітичної інфекції і ліпідів, що входять до складу мембрани блідої трепонеми. Антиліпідний антитіла можуть з`являтися не тільки внаслідок сифілісу чи інших трепанематозов, але і у відповідь на деякі гострі і хронічні захворювання, при яких спостерігається руйнування тканин. Антиліпідний антитіла (реагіни) утворюються через 7-14 днів після утворення шанкра або через 4-5 тижнів після інфікування. В основному нетрепонемні тести застосовуються в двох випадках:
• нетрепонемних тести, в зв`язку з дешевизною, доступністю простотою і швидким терміном виконання, застосовуються для скринінгу сифілісу як відбіркові реакції.
• За зміною кількісних нетрепонемних тестів судять про ступінь ефективності лікування сифілісу і встановлюють його излеченность. Тому нетрепонемні тести застосовуються в комбінації з трепонемная тестами для установки діагнозу сифілісу і проводяться до початку лікування, в процесі лікування і після закінчення лікування в певні часові інтервали.
Недоліки нетрепонемних тестів:
1) Хибнонегативні результати - при дослідженні нерозведених зразків сироватки, що містять велику кількість антитіл, за рахунок так званого феномена Прозона. Це явище може спостерігатися на ранніх стадіях сифілісу і у пацієнтів із супутньою ВІЛ-інфекцією.
2) Недостатня чутливість для діагностики пізній стадії сифілісу
3) Хибнопозитивні результати (біологічні хибнопозитивні реакції) при наявності інших гострих або хронічних захворювань.
А) Тест швидких плазмових реагинов (RPR).
RPR (Rapid Plasma Reagins) - тест швидких плазмових реагинов і його автоматизована модифікація - автоматизований реагиновий тест (ART, Automated Reagin Test). Ці тести можуть зчитуватися візуально через наявність забарвлених речовин в приготованому антигене. Тест RPR був розроблений для польових умов і зараз це найбільш поширений нетрепонемних тест. Він проводиться на пластикових планшетка з Вдрукувати кружечками. При постановці кількісної або якісної модифікацій реакції стандартні кількості нерозведеної сироватки або її серійних розведень змішуються з антигеном, змістом частинки вугілля. Планшету з антигеном і сироваткою обертають при 1000 об / хв протягом 8 хв. Антиген НЕ прикріплюється до цих часток, але при наявності в сироватці антикардіоліпінові антитіл відбувається флоккуляции комплексів антиген-антитіло, частинки вугілля як би потрапляють в пастку в утворену мережу і коагулюють. Результати тесту читаються у вологому місці при яскравому тесті негайно після проведення реакції. У тесті використовується непрогріта сироватка.
Б) VDRL-тест.
VDRL (за назвою лабораторії-розробника - Venereal Disease Research Laboratory). В даному тесті свіжоприготований антиген і інактивована сироватка змішуються в скляній лунці механічним обертанням. Якщо в сироватці присутні антитіла до кардіоліпінового антигену, утворюються агрегати у вигляді коротких стержневідной структур, які виявляються мікроскопічно. Використовується кількісна модифікація VDRL до розведень сироватки 1:64. VDRL є єдиним тестом, рекомендованим для дослідження спинномозкової рідини.
В) Реакція зв`язування комплементу (РСК, реакція Вассермана).
Реакція Вассермана заснована на феномені зв`язування комплементу. У постановці реакції використовують як специфічні антигени з блідих трепонем, так і неспецифічні антигени (кардіоліпіновий - екстракт з м`язи бичачого серця) .Ступінь позитивності реакції Вассермана оцінюють числом плюсів: ++++ (різко позитивна) +++ (позитивна) ++ ( слабоположітельная) + (сумнівна) - (негативна) Реакція Вассермана обов`язково застосовується в комплексі з двома осадовими реакціями (Кана і Закс-Вітебського). Імунологічна сутність цих реакцій не відрізняється від РВ, але для них готують більш концентровані антигени, які при взаємодії з реагинами сироватки дають видимий осад, оцінюваний якісно (++++, +++, ++, +, -). Діагноз первинного серонегативного сифілісу ставлять лише при негативних стандартних серологічних реакціях. Реакція Вассермана (РВ) стає позитивною у 100% хворих у вторинному сіропозитивному періоді сифілісу. При третинному активному сифілісі - у 65-70% пацієнтів. При пізніх формах сифілісу внутрішніх органів і нервової системи - у 50-80% хворих. У хворих на ранній вродженим сифілісом серологічні реакції позитивні майже в 100% випадків. При пізньому природженому сифілісі - в 75-80% випадків.
3. Трепонемні тести.
Як і при нетрепонемних тестах при проведенні трепонемним тестів використовується імунологічна реакція антиген-антитіла. Але як антигенів застосовуються трепонемні антигени - або інтактні трепонеми, або очищені і ультраозвученние трепонеми, або рекомбінантні антигени. Для проведення та виявлення результатів реакції антиген-антитіла використовують більш складні і дорогі методи.
Трепонемні тести є підтверджуючими сифіліс тестами, проте в невеликому відсотку при їх проведенні можуть зустрічатися хибнопозитивні результати.Трепонемние тести застосовуються тільки для діагностики сифілісу і не використовуються для проведення контролю вилікування.
А) Реакція імунофлюоресценції (РІФ).
Принцип РИФ заснований на виявленні флуоресцентних антитіл, так як мічені флюорохромом антитіла не втрачають здатності з`єднуватися з відповідним антигеном і тим самим обумовлюють світіння препаратів в синьо-фіолетових променях ртутно-кварцовою лампи.Отлічітельной рисою РИФ, в порівнянні зі стандартними серологічними реакціями, є більш висока чутливість (РІФ буває позитивною вже в первинному серонегативного періоді сифілісу) при високій специфічності. Відзначено цінність РИФ при виявленні хворих з прихованими і пізніми формами сифілісу при негативних результатах ІБТ. Реакція ставиться в декількох модифікаціях і найціннішою є РИФ-200, основним призначенням якої вважається не рання серодиагностика сифілісу, а розпізнавання неспецифічних результатів комплексу серологічних реакцій і серодиагностика прихованого сифілісу. Однак РИФ-200 не володіє абсолютною специфічністю, тому питання про наявність чи відсутність заболенія має вирішуватися на сукупності клінічних та інших серологічних даних.
РИФ при вторинному сифілісі позитивна в 100% випадків. При третинному активному сифілісі РИФ позитивна у 92-100% пацієнтів. При пізніх формах сифілісу внутрішніх органів і нейросифілісу РИФ позитивна у 94-100% хворих. У хворих раннім і пізнім вродженим сифілісом РИФ позитивна в 100% випадків.
РИФ дуже повільно негатівіруются в процесі противосифилитической терапії. Внаслідок цього вона непридатна для контролю за ходом лікування.
Б) Реакція пасивної гемаглютинації (РПГА).
Гемагглютінаціонний тест для визначення специфічних антитіл до Treponema pallidum. У РПГА використовуються антигени з трепонем, тому він найбільш специфічний. Чутливість і специфічність еквівалентна РИФ-абс. РПГА дозволяє визначити наявність антитіл в зразках, які не реагують в реагінових тестах. Позитивний зразок, виявлений при скринінгу, можна кількісно оцінити при використанні реагентів TPHA-nosticon.
В) Імуноферментний аналіз (ІФА).
В основі методу ІФА лежить наступний принцип: на твердофазном носії (у вітчизняних тест-системах і в більшості тест-систем закордонного виробництва в якості носія використовується поверхню лунок полістиролового планшета) фіксується антиген збудника інфекції, антитіла до якого необхідно виявити. Антиген, іммобілізований на поверхні твердого носія, прийнято називати імуносорбент. Як правило, до складу набору тест-системи входить вже готовий імуносорбент.
В ході інкубації імуносорбенту з випробуваної сироваткою при наявності в ній антитіл до даного антигену відбувається їх зв`язування в комплекс "антиген-антитіло". Після видалення незв`язаних імуноглобулінів слід інкубація з міченими ферментом антитілами до імуноглобулінів людини (кон`югатом), в ході якої на поверхні носія відбувається приєднання до наявних комплексам "антиген-антитіло" антитіл, мічених ферментом (як ферменту найчастіше використовується пероксидаза хрону). Після видалення незв`язаних кон`югату в ході інкубації з розчином субстрату відбувається взаємодія ферменту з субстратом, в результаті чого розвивається кольорова реакція, інтенсивність якої залежить від кількості пов`язаних сироваткових антитіл (у разі використання пероксидазного кон`югату в якості субстрату застосовують перекис водню в поєднанні з ортофенілендіамін (ОФД) , 5-аміносаліцилової кислотою (5-АСК) або тетраметилбензидину (ТМБ)). Результат реакції оцінюється спектрофотометрично з висновком цифрових даних, що виключає суб`єктивність оцінки. Деякі імуноферментні тест-системи допускають візуальну оцінку результатів, що може бути корисно при відсутності відповідного обладнання.
В даний час Міністерством охорони здоров`я Росії рекомендовані до застосування в медичній практиці 10 імуноферментних тест-систем для діагностики сифілісу вітчизняного виробництва:
1. "РекомбіБест антіпаллідум", ЗАТ "Вектор-Бест", п. Кольцово, Новосибірська обл.-
2. "РекомбіБест антіпаллідум - сумарні антитіла", ЗАТ "Вектор-Бест", п. Кольцово, Новосибірська обл.-
3. "ІФА-АНТИ-LUIS", НВО "Діагностичні системи", м Нижній Новгород
4. Тест-система імуноферментна для виявлення антитіл до збудника сифілісу (Treponema pallidum) на основі рекомбінантних білків, БТК "Біосервіс", м Москва-
5. "ЛюісСкрін", ЗАТ "Ниармедик" і АЗОТ "Діаклон", м Москва-
6. "Еколаб-антіпаллідум-скрін", ТОО "Еколаб", г Електрогорськ, Московська обл.-
7. "ІФА-анти-трепонема", ЗАТ "Вектор-Майстар", п. Кольцово, Новосибірська обл.-
8. "АТ-Треп.-ІФТС", ДП "Алерген", м Ставрополь-
9. "Сиф-Ат-№№1,2", ТОО НДІ "Аквапаст", м.Санкт-Петербург-
10. "ІФАанті-СИФ", НПК "Препарат", г. Нижний Новгород.
Г) иммуноблотинга.
Одним із сучасних методів діагностики сифілісу є іммуноблотінга (Western blot) для визначення IgG або IgM. При проведенні иммуноблотинга T. pallidum піддаються електрофорез в градієнті концентрації додецилсульфата натрію, в результаті чого відбувається поділ білкових іммунодетермінант на нітроцелюлозі. Потім проводиться обробка розділених "точок" (blots) досліджуваної сироваткою і антитілами до IgG або IgM, міченими ферментами або радіоактивними речовинами. IgG - іммуноблотінга по чутливості і специфічності подібний РИФ з абсорбцією. Застосування анти-IgM специфічного кон`югату при проведенні иммуноблотинга може служити діагностичним тестом для вродженого сифілісу, більш чутливим у порівнянні з РИФ з абсорбцією.
Д) Реакція іммобілізації блідих трепонем (РІБТ).
ІБТ є діагностично цінною і визнана самим специфічним тестом на сифіліс. Однак її застосування обмежується через дорожнечу досліджень і складності проведення реакції. Постановка РІТ має особливе значення при діагностиці прихованого сифілісу, розпізнаванні уражень внутрішніх органів і нервової системи, при обстеженнях вагітних з підозрою на сифіліс. Суть реакції полягає у втраті рухливості блідими трепонемами в присутності иммобилизинов випробуваної сироватки і активного комплементу. Иммобилизинов з`являються в сироватці крові хворих пізніше, ніж інші антитіла, і ІБТ стає позитивною пізніше стандартних серореакций і РІФ.Оценка результатів реакції проводиться за відсотком іммобілізації блідих трепонем:
? до 20% - отріцательная-
? 21 - 30% - сомнітельная-
? 31 - 50% - слабоположітельная-
? 51 -100% - позитивна.
У первинному періоді сифілісу ІБТ у більшості хворих негативна або слабоположітельная. При вторинному свіжому сифілісі РІТ дає позитивний результат більш ніж у половини хворих, однак, відсоток іммобілізації трепонем невисокий (40-60%). У вторинному рецидивному періоді сифілісу РІТ буває позитивною у 85-90% хворих при вираженому ступені іммобілізації (80-100%). При третинному сифілісі, при специфічних ураженнях внутрішніх органів, нервової системи, коли РВ часто негативна, ІБТ дає позитивні результати в 98-100% спостережень (з високим відсотком іммобілізації). У зв`язку з повільною Негативація в процесі противосифилитической терапії, ІБТ непридатна для контролю за ходом леченія.Прі ранньому природженому сифілісі РИБТ позитивна у 90-98% дітей, при пізньому природженому сифілісі - майже у 100% хворих. Діагноз прихованого сіро-позитивного сифілісу ставиться тільки за позитивними серореакцій крові з обов`язковим підтвердженням їх ІБТ.
Поділитися в соц мережах:
Схожі
